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蛋白的定量濃度實驗之恒溫培養(yǎng)箱應用

更新時間:2019-04-22點擊次數:1577

     今天喆圖小編來給大家講講用恒溫培養(yǎng)箱做蛋白定量濃度實驗:

     1、吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液。

     2、往培養(yǎng)皿中加入2ml冷的PBS輕輕蕩洗2~3次,MAX后一次,吸干培養(yǎng)皿中的PBS。

     3、每個培養(yǎng)皿中加入70μl(以FLS細胞為例)裂解液。

裂解液的配置:

     RIPA裂解液:蛋白酶/磷酸酶抑制劑混合物:RIPA裂解液(中)B液=100:1:1

     4、將加入裂解液的培養(yǎng)皿輕輕搖晃,使裂解液與貼壁細胞充分接觸,放入—70℃的低溫冰箱,冷凍10分鐘。

     5、裂解完后,用干凈的刮刀將細胞刮于培養(yǎng)皿的一處,然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。

     6、將離心管置于小型離心機上渦旋一下,然后置于4℃低溫冰箱放置30min。

     7、將離心管放入高速離心機,于4度下12000rpm離心5min。

     8、取出離心管,吸取上清液,上清液即蛋白液,對其進行定量,轉移至新的1.5ml離心管。

     9、對提取的上清液進行蛋白濃度的定量

蛋白定量的過程

     ①取干凈的96孔板,進行區(qū)域選擇板底掃描即讀板

     ②首先在96孔板中加入18ul的PBS

     ③在18ul的PBS中加入2ul的樣品

     ④MAX后在加入200ul的BCA(加入后的BCA不進行與樣品的混合,而是鋪在樣品的上面,用吹風機除去上方的氣泡)

     BCA的配置:BCA試劑A:BCA試劑B=50:1

     ⑤放置37°恒溫培養(yǎng)箱孵育30min

     ⑥讀板(吸光光度值為562)

     10、對剩余的樣品按照體積5:1的比例加入Loading Buffer(6X)

     11、將加好的樣品放入離心機順離,使離心管內壁的樣品甩下。

     12、將樣品放入恒溫金屬浴鍋中100℃煮7min

     13、將煮好的蛋白放入—20℃低溫冰箱中備用

    以上內容由喆圖小編編輯發(fā)布,如需了解恒溫培養(yǎng)箱詳情請聯系喆圖客服!

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